關(guān)于單克隆抗體
1.抗原(Antigen)
在介紹抗體之前,我們首先來認識一下抗原是什么?抗原是指能夠刺激機體產(chǎn)生(特異性)免疫應(yīng)答,并能與免疫應(yīng)答產(chǎn)物抗體和致敏淋巴細胞在體外結(jié)合,發(fā)生免疫
2.抗體(Antibody)
抗體指機體的免疫系統(tǒng)在抗原刺激下,由B淋巴細胞分化成的漿細胞所產(chǎn)生的、可與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的免疫球蛋白。
3.單克隆抗體以及開發(fā)歷程
單克隆抗體(monoclonal antibody, mAb)是B細胞產(chǎn)生的高度均一、僅針對某一特定抗原表位的抗體。用來鑒別和清除外源物質(zhì)如細菌、病毒等的一種“Y”形免疫球蛋白。通常,天然抗體由兩條重鏈(H鏈)和兩條輕鏈(L鏈)構(gòu)成。重鏈較長、相對分子量較大;輕鏈較短、相對分子量較??;鏈間由二硫鍵和非共價鍵連接形成一個的單體分子。整個抗體還可進一步分為恒定區(qū)(C區(qū))和可變區(qū)(V區(qū))兩部分。
單克隆抗體制備中的技術(shù)
1975年,英國科學(xué)家Kohler和Milstein 首次將壽命長但不能產(chǎn)生特異性抗體的小鼠骨髓瘤細胞與壽命短但經(jīng)免疫后可產(chǎn)生特異性抗體的漿細胞(綿羊紅細胞免疫的小鼠脾細胞)在體外進行融合,創(chuàng)建了雜交瘤技術(shù),得益于該技術(shù),mAbs才實現(xiàn)了大量制備,用于基礎(chǔ)研究,并具備臨床轉(zhuǎn)化能力,開啟了單克隆抗體藥物開發(fā)的新紀元。
下圖所示為單克隆抗體的經(jīng)典制備方法,向小鼠體內(nèi)注射特定抗原以引發(fā)免疫反應(yīng),得到相應(yīng)的B淋巴細胞,將其和小鼠骨髓瘤細胞融合,篩選后把獲得的雜交瘤細胞在體外大規(guī)模培養(yǎng),擴增單克隆抗體。
單克隆抗體開發(fā)的四個階段
單克隆抗體的發(fā)展主要經(jīng)歷了四個階段:鼠源性單克隆抗體、人鼠嵌合性單克隆抗體、人源化單克隆抗體和全人源單克隆抗體。由于鼠源性抗體適用于人體時總會產(chǎn)生這樣那樣的不良反應(yīng),因此人源化抗體才是未來藥物的發(fā)展趨向。
單克隆抗體的應(yīng)用
檢驗醫(yī)學(xué)診斷試劑:廣泛用于酶聯(lián)免疫吸附試驗、放射免疫分析、免疫組化、流式細胞等技術(shù)。并且單克隆抗體的應(yīng)用,很大程度上促進了商品化試劑盒的發(fā)展,廣泛用于抗原抗體、激素、細胞因子等的檢測。
蛋白質(zhì)提純:作為親和層析中的重要配體,制備成層析柱,實現(xiàn)蛋白質(zhì)的分離純化。
腫瘤的導(dǎo)向治療和放射免疫顯現(xiàn)技術(shù):利用單克隆抗體的導(dǎo)向作用,將藥物與單克隆抗體連接導(dǎo)向靶細胞,直接殺傷靶細胞;以及將放射性標記物與單克隆抗體連接進行放射免疫顯像。
單克隆抗體工藝的過濾解決方案
單克隆抗體的生產(chǎn)工藝階段,主要有上游細胞的培養(yǎng)過程、細胞培養(yǎng)液的收獲和澄清過程、下游分離純化過程。其中上游細胞培養(yǎng)完成后所獲得的含有抗體的細胞培養(yǎng)液會含有蛋白酶、宿主細胞、細胞碎片、宿主細胞蛋白、宿主細胞核酸及培養(yǎng)基與加料液成分等污染物,影響抗體的穩(wěn)定性和純度,需要經(jīng)過去除使細胞液澄清后才能用于后續(xù)的抗體分離純化過程;下游的分離純化的主要目的是將抗體與工藝相關(guān)雜質(zhì)和產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)分離,最終獲得高純度、低潛在危害的抗體藥物。
上游細胞的培養(yǎng)過程:
下游工藝過程-三步層析法:
其中過濾在其的不同工藝階段都有很廣泛的應(yīng)用,主要有培養(yǎng)基的除菌過濾、氣體的除菌過濾、緩沖液的除菌過濾、死細胞和細胞碎片的澄清過濾,超濾濃縮、層析純化、終端產(chǎn)品的除菌過濾、除病毒過濾等。
20000L的生產(chǎn)流程:
傳統(tǒng)單克隆抗體制備工藝流程圖:
其主要的過濾位點有:
1.培養(yǎng)基過濾:去除細胞培養(yǎng)基中細菌和微生物;
2.呼吸器/氣體過濾:氣體的除菌過濾主要應(yīng)用于生物反應(yīng)器的進氣及排氣過濾,各種儲罐及配料罐的呼吸器等,主要是去除氣體中的細菌等微生物;
3.ATF:切向流過濾,去除死細胞和細胞碎片以及脂類、膠體、顆粒等雜質(zhì)去除;
4.緩沖液過濾:緩沖液的除菌過濾,延長層析柱和超濾膜使用壽命;
5.保安過濾:超濾前預(yù)過濾,保護超濾模組;
6.終端除菌過濾:去除終端濾液中細菌和微生物。